通過下一代測序 (NGS) 來驗證，能夠在核苷酸水平分辨率下進行大規(guī)模評估基因編輯的準確性和可靠性。高效、可自動化和可擴展的 CIRCLE-seq 是一種體外 NGS 測定，可以對 CRISPR 介導的切割進行靈敏的脫靶檢測。

CRISPR-Cas9 基因編輯

CRISPR 代表成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列。這些重復的 DNA 片段最初來源于病毒病原體，并作為模板將 CRISPR 相關蛋白 9 (Cas9) 核酸內切酶引導至新入侵的病毒。當 Cas9 遇到同源病毒序列時，它會產生近端雙鏈斷裂 (DSB)。類似地，當 Cas9 和指導 RNA (gRNA) 被轉染到哺乳動物細胞中時，接近 gRNA 的同源序列被切割。然后通過內源性易出錯的非同源末端連接 (NHEJ) 過程將末端重新連接在一起，或使用外源提供的供體（修復）模板通過同源定向修復 (HDR) 進行修補，從而修復 DSB。

研究人員使用 HDR 以已知且可預測的方式改變基因序列。gRNA 決定編輯將在何處進行，而供體模板 DNA（其末端與 DSB 站點共享同源性）決定編輯的外觀。

由于這些是關鍵組件，因此確保 gRNA 和修復模板沒有錯誤非常重要。使用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶等優(yōu)質試劑進行擴增有助于確保準確性和特異性。

NGS 驗證法

   即使使用的聚合酶為 CRISPR HDR 生成準確的修復模板，實驗室也需要一種方法來驗證基因編輯是否成功——編輯的位點包含預期的序列。NGS 提供了一種高通量、自動化友好的方法來驗證克隆分離物中的目標基因編輯。

   為了從 NGS 中獲得最佳結果，強大的文庫制備必不可少。Dana-Farber 癌癥研究所的分子生物學核心設施 (MBCF) 發(fā)現(xiàn) KAPA HyperPrep 試劑盒提供的工作流程能夠適應各種擴增子輸入量和大小，從而最大限度地減少輸入 QC 和特定樣本工作流程修改的需要. 使工作流程適應他們的自動液體處理系統(tǒng)，允許在大約 3-1/2 小時的儀器時間內基于擴增子的文庫制備 96 個克隆樣本。

CRISPR的切割位點的優(yōu)化

   驗證預期的位點是否已成功修改是一回事，但無論計算機設計多么徹底，基于 CRISPR/Cas9 的基因編輯中使用的 Cas9 核酸酶都有可能以類似的方式切割和改變非預期的目標序列。因此，實驗室需要一種方法來識別可能的脫靶切割位點，并能夠將這些位點與擴增導致的簡單錯誤區(qū)分開來。有幾種 NGS 工作流程可以實現(xiàn)這一點。

    例如，Digenome-seq 是一種相對簡單的體外檢測方法，其中使用 Cas9 核酸酶切割從目標細胞中提取的基因組 DNA，將 NGS 測序接頭連接到所有游離端，并對生成的文庫進行測序以鑒定削減。然而，由于文庫沒有針對切割位點進行富集，因此未修飾 DNA 的背景很高，需要大量的測序讀數(shù)，并且很難找到罕見的切割事件。

GUIDE-seq 方法

   通過先在體內富集摻入 Cas9 引入的 DSB 中的寡核苷酸來降低測序成本。但它的靈敏度較低，并且作為一種基于細胞的檢測方法，它既費時又費力，而且僅限于易于轉染的細胞。

    CIRCLE-seq 代表 Circularization for In vitro Reporting of Cleaveage Effects by SEQuencing，它結合了靈活的體外工作流程和僅選擇性測序 Cas9 切割的 DNA 的所有富集優(yōu)勢。1 隨機剪切的基因組 DNA 被環(huán)化，然后用 Cas9 切割. 只有具有切割位點的分子才會進入文庫制備、PCR 擴增和 NGS 的后續(xù)步驟，以揭示易受 Cas9 切割影響的序列。

     作為一種體外試驗，CIRCLE-seq 避免了 CRISPR QC 基于細胞的方法中冗長的細胞培養(yǎng)步驟。此外，CIRCLE-seq 是一種可擴展、靈敏的技術，與其他體外方法相比，需要更少的測序讀數(shù)，從而降低測序成本。CIRCLE-seq 的成功需要使用 CRISPR基因編輯試劑等進行高效的文庫制備，可減少文庫擴增過程中擴增偏差的高保真 DNA 聚合酶。

   基于 NGS 的工具可在每個階段對 CRISPR/Cas9 介導的編輯進行核苷酸水平的驗證。

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