HeLa細(xì)胞全基因組CRISPR篩選對病原侵染機制研究

研究背景

·  艱難梭菌感染（CDI）是發(fā)達(dá)國家醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)獲得性腹瀉及胃腸道炎相關(guān)死亡的主要原因之一，每年在美國導(dǎo)致約50萬例病例和1.5萬例死亡。

·  近年來，由于超級毒力菌株的出現(xiàn)和廣泛傳播，CDI的全球負(fù)擔(dān)有所加劇。艱難梭菌產(chǎn)生三種致病性相關(guān)的外毒素：毒素A（ TcdA ）、毒素B（TcdB）和艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶（CDT）。

·  在這三種毒素中，TcdB在引起胃腸道疾病中起著關(guān)鍵作用。TcdB是艱難梭菌的主要毒性因子，分為至少8個自然變種/亞型，其中1-4型與人類疾病相關(guān)。

·   第二群（clade 2）艱難梭菌，也稱為超級毒力群，僅表達(dá)兩種TcdB變種（TcdB2和TcdB4），這些變種不識別經(jīng)典的Frizzled（FZD）受體。目前還不清楚這些TcdB變種如何靶向腸上皮細(xì)胞引發(fā)組織損傷。

研究思路

CRISPR/Cas9篩選： 研究人員使用CRISPR/Cas9篩選技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)尋找TcdB4的受體。通過篩選，他們發(fā)現(xiàn)組織因子途徑抑制物（TFPI ）是TcdB4的受體。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究： 為了深入了解TcdB4與TFPI的結(jié)合機制，研究人員使用冷凍電鏡技術(shù)確定了TcdB4與TFPI復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)了一個對TcdB來說共同的受體結(jié)合區(qū)域。

功能驗證： 為了驗證TFPI在體內(nèi)是否是TcdB4的受體，研究人員使用了TFPI敲除的小鼠模型，并在小鼠結(jié)腸環(huán)扎模型中測試了TFPI對TcdB4介導(dǎo)的腸道損傷的保護作用。

策略的探索： 最后，研究人員探索了同時抑制TFPI和CSPG4兩種受體結(jié)合位點的方法，以提供合適的TcdB保護效果。

研究結(jié)論

1. 通過細(xì)胞病變細(xì)胞圓潤化測定實現(xiàn)TcdB的毒素對不同類型的細(xì)胞的影響，HeLa細(xì)胞敏感性最低（最抗?。?，選擇HeLa細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組CRISPR-Cas9篩選。

• 細(xì)胞病變細(xì)胞圓潤化測定 (cytopathic cell-rounding assays)：一種實驗方法，用來檢測毒素等物質(zhì)對細(xì)胞的影響，通常是通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化（如變圓）來評估細(xì)胞毒性。
• CR50：指引起50%細(xì)胞圓潤化的毒素濃度，50%為標(biāo)準(zhǔn)   衡量不同細(xì)胞系在病毒侵染篩選下的細(xì)胞敏感性.

• 在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組CRISPR-Cas9篩選，GeCKO v2向?qū)NA ( gRNA )文庫并進(jìn)行3輪TcdB4選擇

2. NGS進(jìn)行解碼對識別的基因進(jìn)行排序和繪圖，標(biāo)記出至少靶向三個gRNA的富集基因前30個。

3. 使用CRISPR-Cas9方法生成了TFPI-，PIGX-，PIGM-，和PIGP的KO HeLa細(xì)胞進(jìn)行病毒侵染篩選，獲得敏感性基因TFPI，表明細(xì)胞表面蛋白TFPI也是TcdB2的受體，但是傳統(tǒng)FZD1受體不是TcdB2的受體。

• 細(xì)胞表面蛋白TFPI（組織因子途徑抑制物）： 是一種在人體內(nèi)參與血液凝固調(diào)控的蛋白質(zhì)。它主要存在于細(xì)胞膜上和細(xì)胞外空間 ，TFPI（組織因子途徑抑制物）的不同形式，可能與毒素進(jìn)入細(xì)胞的過程相關(guān)。

• CSPG4、FZD1-2-7、TFPI： 這些都是細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞對TcdB4的敏感性有關(guān)。

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4. TcdB4對HeLa細(xì)胞的毒性機制通過和細(xì)胞表面結(jié)合發(fā)揮作用，膜蛋白TFPI和CSPG4正向調(diào)控，TFPI作用尤為明顯。

（圖2C）磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）的預(yù)處理減輕了TcdB4在HeLa細(xì)胞中引起的細(xì)胞病變;

（圖2D） RAC1 糖基化免疫印跡進(jìn)一步證實了TFPI/細(xì)胞敏感性的增加（圖2D）。

（圖2E）免疫印跡法監(jiān)測了HeLa WT、FZD1/2/7/，CSPG4/，和TFPI/敲除細(xì)胞中TcdB4的表面結(jié)合。TcdB4同樣結(jié)合于WT和FZD1/2/7/細(xì)胞的細(xì)胞表面。在CSPG4/細(xì)胞中，TcdB4的結(jié)合略有減少，而在TFPI/細(xì)胞中則顯著減少

• PI-PLC： 磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C），是一種影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)的酶，，能夠切割磷脂分子并釋放GPI-錨定的蛋白質(zhì)。

• RAC1糖基化：指的是RAC1蛋白質(zhì)的一種翻譯后修飾，這里用作評估毒素作用的一個指標(biāo)。

5. TFPIa和TFPIb蛋白互作機制：

6. TFPIK1+K2（效應(yīng)子）加量后可以使TcdB4侵染HeLa CSPG4/使細(xì)胞血紅蛋白運輸加快 ，且受 細(xì)胞膜表面CSPG4正向調(diào)控。

A.TFPIK1+K2-Fc、TFPIK1-Fc和TFPIK2-Fc的亞基結(jié)構(gòu)示意圖

B.TFPIK1+K2保護HeLa CSPG4-敲除細(xì)胞免受TcdB4的影響，但不保護TcdB1（血紅細(xì)胞運輸變慢感?。?/section>

C 系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，TFPIK2的一級序列與TFPIK1的親緣關(guān)系最為密切，相似性67.9%

• TFPIa在介導(dǎo)TcdB4的細(xì)胞進(jìn)入方面具有二元效應(yīng)，由于TFPIa和TFPIb都可以介導(dǎo)TcdB4的結(jié)合-進(jìn)入，推測TcdB4與TFPI的K1和K2結(jié)構(gòu)域（TFPIK1+K2）相互作用。

  
  

7. TcdB4中L1599、K1435、L1434、V1492、L1494、M1438和D1468的點突變?nèi)∠薚FPI結(jié)合能力，表明這些位置對受體識別很重要（TcdB4毒力因子識別位點）。

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