標(biāo)簽：pcr擴(kuò)增 熒光定量pcr  定量pcr  pcr儀 pcr實(shí)驗(yàn)室  PCR擴(kuò)增儀 基因擴(kuò)增儀

PCR檢測(cè)方法有很多，其中PCR擴(kuò)增儀又稱(chēng)為“PCR儀”，它是PCR實(shí)驗(yàn)中不可缺少的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備之一。PCR儀器大致可以分為三類(lèi)：即：普通PCR儀，熒光定量PCR儀，梯度PCR儀和原位PCR儀等。 

一、PCR的原理 

在pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)過(guò)程實(shí)質(zhì)就是DNA按模板復(fù)制而發(fā)生的聚合酶鏈反應(yīng)的過(guò)程，主要包括引物、dNTP、DNA靶序列、DNA聚合及PH緩沖液體系。

PCR反應(yīng)過(guò)程如下：

1.通過(guò)升溫反應(yīng)體系混合物一般為：94℃/15s-30s.使目標(biāo)DNA雙螺旋的氫鍵產(chǎn)生斷裂從而形成單鏈DNA作為合成模板.

2、在反應(yīng)體系冷卻至引物的TM值左右，使引物與單鏈DNA模板產(chǎn)生互補(bǔ)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)DNA的互補(bǔ)擴(kuò)增，這一過(guò)程也被稱(chēng)之為退火。

3、擴(kuò)增延伸

在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度升高到72 ℃左右時(shí)，引物在TAQ聚合酶的作用下，以引物為起點(diǎn)dNTP作為底物合成新的DNA鏈條。

 以上步驟重復(fù)循環(huán)，直擴(kuò)增量達(dá)到基因檢測(cè)的所需要數(shù)量即可停止循環(huán)。

使用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題：

無(wú)明顯的擴(kuò)增條帶

這種情況主要是由于以下情況產(chǎn)生： 

（1）Taq酶失活或Taq酶活性加入量少所造成。DNA聚合Taq酶的保存溫度一般在-20℃環(huán)境下，盡量避免反復(fù)凍融所產(chǎn)生的影響。

（2）混合模板反應(yīng)體系中如果含有甲酸、甲醛含等雜質(zhì)也會(huì)對(duì)DNA鏈上的堿基造成影響，降低PCR擴(kuò)增效果。

（3）PCR儀的各反應(yīng)階段適宜溫度設(shè)定也很重要，過(guò)高或過(guò)低的反應(yīng)溫度，都會(huì)使DNA聚合酶產(chǎn)生失活。

（4）引物設(shè)置不合理或反應(yīng)系統(tǒng)中被蛋白酶及核酸酶，這些因素也同樣會(huì)影響到DNA的合成與產(chǎn)出。

 （5）另外，PCR循環(huán)數(shù)不足或者延伸擴(kuò)增時(shí)間短也會(huì)影響到PCR產(chǎn)物產(chǎn)量。

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