小黄人福利导航,日本大片免费高清不卡

您的位置： 首頁 > 技術(shù)文章 > PCR實(shí)驗(yàn)步驟

PCR實(shí)驗(yàn)步驟

作者：蘇州阿爾法生物編輯： PCR儀多少錢一臺(tái) 來源：朗基發(fā)布日期： 2023.09.11

信息摘要：

DNA聚合酶是實(shí)驗(yàn)室中常用的生物學(xué)酶之一，在PCR實(shí)驗(yàn)中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)室常用的DNA聚合酶，包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶和Tth聚…

DNA聚合酶是實(shí)驗(yàn)室中常用的生物學(xué)酶之一，在PCR實(shí)驗(yàn)中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)室常用的DNA聚合酶，包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶和Tth聚合酶。

一、Taq聚合酶：

Taq聚合酶是由Thermus aquaticus細(xì)菌產(chǎn)生的一種DNA聚合酶，在分子生物學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。Taq聚合酶具有熱穩(wěn)定性，可以在高溫條件下保持活性，這是由于其來源于熱液生物，能夠存活和正?；顒?dòng)于高溫環(huán)境。這使得Taq聚合酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中起到關(guān)鍵的作用。Taq聚合酶能夠按照DNA模板合成新的DNA鏈，因此在PCR中用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段。然而，Taq聚合酶缺乏3'-5'外切酶活性，導(dǎo)致其生成的PCR產(chǎn)物末端容易出現(xiàn)額外的腺嘌呤堿基。因此，在某些應(yīng)用中，需要使用具有外切酶活性的聚合酶。

二、Pfu聚合酶：

Pfu聚合酶是由Pyrococcus furiosus細(xì)菌產(chǎn)生的一種DNA聚合酶。與Taq聚合酶相比，Pfu聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性和耐酶性。這使得Pfu聚合酶在高溫PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出色，其高度穩(wěn)定的酶活性能夠確保PCR反應(yīng)的可靠性和準(zhǔn)確性。此外，Pfu聚合酶還具有3'-5'外切酶活性，可以修復(fù)并糾正PCR反應(yīng)中的腺嘌呤堿基誤配，有效防止誤差累積。因此，Pfu聚合酶適用于需要高度準(zhǔn)確的PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序。

三、Tth聚合酶：

Tth聚合酶是由Thermus thermophilus HB8細(xì)菌產(chǎn)生的一種DNA聚合酶。與Taq聚合酶和Pfu聚合酶不同，Tth聚合酶具有熱活性反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶活性，可以將RNA模板合成相應(yīng)的DNA鏈。因此，Tth聚合酶在逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）中得到廣泛應(yīng)用，用于將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA，并通過增加熱活性酶來實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。此外，Tth聚合酶還具有一定的外切酶活性，可用于修復(fù)和校正PCR產(chǎn)物的末端。

這三種酶的主要區(qū)別在于：Taq聚合酶適用于普通PCR擴(kuò)增；Pfu聚合酶適用于需要高準(zhǔn)確性的PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序；Tth聚合酶適用于逆轉(zhuǎn)錄PCR。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和需求，選用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶有助于確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

1. 按下列組成在 PCR 反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液：

TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方

Reagent	Quantity, for 50μl of reaction mixt ure
10X PCR buffer （ Mg2+ free）	5 μ l
MgCl2（25 mM）	如 TaKaRa Taq TM 加 3 μl
MgCl2（25 mM）	如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 μl
2.5mM dNTP mix	4 μ l
10μM Primer 上游	1 μ l
10μM Primer 下游	1 μ l
Template DNA	1 μ l
Taq 或 E XTaqDNA Polymerase	0.25 μl
Sterile deionized water	Up to 50μl
Total	50 μl /Sample

PCR實(shí)驗(yàn)中Pyrobest TM DNA Polymerase 的配方

Reagent	Quantity, for 50μl of reaction mixture
10X Pyrobest buffer	5μ l
2.5mM dNTP mix	4μ l
10μM Primer 上游	1μ l
10μM Primer 下游	1μ l
Template DNA	1μ l
Pyrobest TM DNA Polymerase	0.25μl
Sterile deionized water	Up to 50μl
Total	50μl /Sample

① 反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做 20~50μl 以節(jié)約試劑；

② 將上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 滅菌的 PCR 薄壁管中；

③ 如果不用 PCR 儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加 30 ~50μl 的礦物油防止樣品在 PCR 的過程中蒸發(fā)；

2. 按以下程序進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

PCR實(shí)驗(yàn)中PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件，PCR儀的不同而各異，在實(shí)際操作中需根據(jù)具體的情況以及 PCR 結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)化。

Step

Temperature,

° C

Time, min

Number of

cycles

Note

起始變

性

94~95

1-3

變性

94~95

0.5-2

25-35

退火溫度比理論退火 溫度大概低 5°C ，再

根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化

退火

37-70

0.5-2

延伸

70-75

根據(jù)擴(kuò) 增產(chǎn)物

的大小

每分鐘延伸 1000bp

最終延

伸

70-75

使用朗基PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品 5μl，用天能瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用 DNA marker 判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。

蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司成立于2008年，位于蘇州園區(qū)生物納米園（Biobay）A5幢301室。公司管理團(tuán)隊(duì)專注于科學(xué)儀器行業(yè)十四年，擁有專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)與完善的售后服務(wù)體系，目前已為300余家實(shí)驗(yàn)室提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)，涵蓋各大高校、檢測(cè)中心、科研機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)等13個(gè)群體。提供的實(shí)驗(yàn)室儀器主要包括振蕩培養(yǎng)箱，恒溫恒濕培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀，瑞寧移液器，生物反應(yīng)器，發(fā)酵罐，超低溫冰箱，液氮罐，高壓滅菌器，超純水機(jī)，天平，離心機(jī)，離心濃縮儀、研磨機(jī)、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業(yè)授權(quán)包括知楚儀器、朗基、中科美菱，梅特勒，樂楓，搏旅、NEST、天根、奧盛在內(nèi)的80個(gè)余廠家。

四張拼圖

查看詳情 + 上一條使用高通量PCR儀的檢測(cè)步驟有哪些
: 查看詳情 + 下一條梅特勒托利多的瑞寧移液器如何清潔？

返回列表

本文標(biāo)簽： PCR實(shí)驗(yàn)步驟朗基PCR儀 PCR儀多少錢一臺(tái)

【相關(guān)推薦】

阿爾法推薦資訊

: qPCR 常見問題及解決方法

qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）技術(shù)以其高靈敏度、高特異性和快速性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域。

2024-09-26

: 抗體生產(chǎn)中常用的實(shí)驗(yàn)室儀器實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)耗材一覽表

抗體研發(fā)生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種實(shí)驗(yàn)室儀器、試劑和耗材。以下是抗體研發(fā)生產(chǎn)中常用的實(shí)驗(yàn)室儀器、試劑和耗材的一覽表：實(shí)驗(yàn)室儀器：1.電子天平-用于精確稱量試劑和樣品。2.磁力攪拌器-用于攪拌溶液，加速反應(yīng)。3.離心機(jī)-用于分離混合物中的不同成分。4.PCR儀-聚合酶鏈反應(yīng)儀器，用于擴(kuò)增DNA片段。5.凝膠成像......

2024-07-10