使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分析的流式細(xì)胞術(shù)廣泛用于分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)、鑒定并確定異質(zhì)細(xì)胞群中的不同細(xì)胞類型、評估分離亞群的純度以及分析細(xì)胞大小和容積。

   主要用于測定熒光標(biāo)記的抗體檢測蛋白產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，或結(jié)合了特定細(xì)胞分子的配體，如碘化丙啶與 DNA 的結(jié)合。

其染色過程包括從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織樣品制備單細(xì)胞懸液。然后將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)在包含未標(biāo)記或熒光標(biāo)記抗體的試管或多孔板中，再用流式細(xì)胞儀分析。

流式細(xì)胞儀主要有兩型：

小型機(jī)和綜合型。除具備檢測分析功能外，還具有細(xì)胞分選功能，多用于科學(xué)研究。

流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)：

1.流式細(xì)胞儀的分析速度：

一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～5000個細(xì)胞，大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個細(xì)胞；

2.式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度：

一般能測出單個細(xì)胞上<600個熒光分子，兩個細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分；

3.前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：

前向角散射（FSC）反映被測細(xì)胞的大小，一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm ～0.5μm；

4.流式細(xì)胞儀的分辨率：

通常用變異系數(shù)CV值來表示，一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%，這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達(dá)到的；

5.流式細(xì)胞儀的分選速度：

一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99% 以上；

細(xì)胞內(nèi)染色：

用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)抗原染色方案取決于可讓抗體接近內(nèi)部細(xì)胞蛋白的固定和透化方法。無論何種情況，成功的染色都離不開通過抗體滴定進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化、使用適合的對照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀以及優(yōu)化的固定和透化步驟。

分泌蛋白的檢測：

分泌蛋白的檢測十分困難，因?yàn)榈鞍讜跈z測前從細(xì)胞中釋放出來且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達(dá)蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細(xì)胞內(nèi)染色法檢測靶標(biāo)蛋白。

熒光染料偶聯(lián)劑的選擇

給定的抗體能否從陰性信號中分辨陽性信號取決于所用的熒光染料偶聯(lián)劑。

   各熒光染料的相對強(qiáng)度一般指導(dǎo)原則是，從亮到暗依次為：PE、PE-Cy 7、PE-Cy5 、APC、APC-Cy7、Alexa Fluor 647?、 Alexa Fluor 700?、FITC、Pacific Blue 和 Alexa Fluor 488?。這是一般排序，個別抗體的相對強(qiáng)度可能有所差異。

    高度表達(dá)的抗原通?？杀粰z測且與陰性對照區(qū)分開來，無論使用何種熒光染料。表達(dá)較少的抗原需要較亮的 PE 或 APC 偶聯(lián)劑提供的高信號背景比，以將陽性細(xì)胞完全從未染色的細(xì)胞中區(qū)分開來。

在流式細(xì)胞儀中，Cv值（即變異系數(shù)）的高低反映了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的離散程度。通常情況下，較低的Cv值表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性更高。

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