RNA提取是生物學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。本文將詳細(xì)介紹使用Trizol 法提取組織和細(xì)胞中的RNA的實(shí)驗(yàn)操作方法。

一、準(zhǔn)備工作

1. 將所有需要使用的試劑、儀器和材料準(zhǔn)備齊全，并保持干凈和無(wú)RNase污染。

2. 預(yù)先制備好1ml Trizol試劑，加入0.2ml氯仿，1ml異丙醇，以及1ml 75%乙醇。

二、組織樣本的RNA提取

1. 收集50～100mg待提取RNA的組織樣本，并用1ml Trizol試劑對(duì)樣本進(jìn)行裂解。

2. 將裂解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml離心管中，室溫下靜置5分鐘。

3. 向離心管中加入相同體積的氯仿，蓋上離心管蓋子，并在手中用力震蕩15秒。

4. 將離心管放置在室溫下2-3分鐘，隨后以12000g（2℃～8℃）離心15分鐘。

5. 將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中，并加入相同體積的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。

6. 以12000g（2℃～8℃）離心10分鐘，將離心管中的上清廢棄。

7. 使用1ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，以7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，將上清廢棄。

8. 讓RNA沉淀在離心管中室溫下自然干燥。

9. 最后使用RNase-free水溶解RNA沉淀，得到提取的RNA樣品。

三、細(xì)胞樣本的RNA提取

1. 收集5-10×10^6個(gè)細(xì)胞，并離心沉淀。

2. 向細(xì)胞沉淀中加入1ml Trizol試劑，并通過(guò)槍吹打或劇烈振蕩的方式裂解細(xì)胞。

3. 將裂解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml離心管中，室溫下靜置5分鐘。

4. 后續(xù)步驟同組織樣本的RNA提取的步驟3-9。

四、RNA溶解

RNA的溶解是提取后得到RNA樣品關(guān)鍵步驟。在這一步驟中，我們需要使用RNase-free（無(wú)RNase酶）的水來(lái)溶解RNA沉淀，以確保RNA的完整性和純度。

為了溶解RNA沉淀，具體步驟如下：

1. 準(zhǔn)備好RNase-free水，在一個(gè)干凈的離心管中加入適量的水量。

2. 將已經(jīng)干燥的RNA沉淀加入RNase-free水中。根據(jù)需求，可以調(diào)整加入的RNase-free水的量，以獲得所需的RNA濃度。

3. 在溶解過(guò)程中，可以使用微量分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量RNA的濃度和純度。

4. 設(shè)置光度計(jì)的波長(zhǎng)為260nm，并在沒(méi)有樣品的情況下進(jìn)行基線校正。

5. 然后，將RNase-free水作為空白樣本進(jìn)行校正。接下來(lái)，使用1cm的光程將溶解后的RNA樣品轉(zhuǎn)移至光度計(jì)比色皿中，并進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)讀數(shù)可以計(jì)算出RNA的濃度和純度。

需要注意的是，為了確保準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果，必須保持光度計(jì)和比色皿的清潔，并避免在操作過(guò)程中引入任何可能導(dǎo)致RNA降解的RNase污染。

總之，RNA的溶解是提取后處理的最后一步，通過(guò)使用RNase-free水溶解RNA沉淀，可以得到高質(zhì)量和純度的RNA樣品。利用微量分光光度計(jì)可以方便地檢測(cè)RNA的濃度和純度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了富有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)。

通過(guò)使用Trizol法提取RNA樣品，可以有效地獲得高質(zhì)量的RNA。這種方法適用于從組織和細(xì)胞中提取RNA，并且可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究，如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和基因表達(dá)分析等領(lǐng)域。

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