由于T細(xì)胞具有多種亞型，所以研究膜結(jié)合T細(xì)胞受體的技術(shù)困難，但在某些情況下，您希望能夠做到這一點(diǎn)，例如分析哪些免疫記憶已被誘導(dǎo)以測(cè)量個(gè)體對(duì)特定抗原的反應(yīng)程度。此時(shí)， 有多種方法可以實(shí)現(xiàn)，主要分為兩大類：一種是通過(guò)測(cè)量特征性反應(yīng)（例如細(xì)胞因子分泌）來(lái)檢測(cè) T 細(xì)胞對(duì)刺激作出反應(yīng)的激活，另一種是通過(guò)細(xì)胞的特異性來(lái)分析T細(xì)胞受體。

下面總結(jié)了一下 T細(xì)胞分析的6種方法：

1. 限制稀釋培養(yǎng)

該技術(shù)涉及通過(guò)使用不同稀釋度的細(xì)胞來(lái)測(cè)量對(duì)特定抗原產(chǎn)生反應(yīng)的 T 細(xì)胞的頻率，然后測(cè)量無(wú)反應(yīng)的孔數(shù)。

不用過(guò)多計(jì)算，簡(jiǎn)而言之，每個(gè)孔中活性 T細(xì)胞的分布應(yīng)遵循泊松分布隨機(jī)分布原則。我們可以使用這些信息來(lái)計(jì)算我們擁有的活躍 T 細(xì)胞的數(shù)量。從泊松分布中我們知道，如果反應(yīng)陰性的孔比例為 37%，那么每個(gè)孔中平均有一個(gè)抗原特異性 T 細(xì)胞。因此讀取產(chǎn)生 37% 陰性孔的細(xì)胞數(shù)，然后我們可以計(jì)算響應(yīng)細(xì)胞的頻率。例如，如果以每孔 5000 個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞導(dǎo)致 37% 的細(xì)胞呈陰性，我們知道我們有 1/5000 個(gè)活躍細(xì)胞的頻率。啟動(dòng)或免疫小鼠后，頻率相應(yīng)增加，就表明抗原正在驅(qū)動(dòng)增殖。

2. ELISPOT

如果需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表型分析，有限稀釋培養(yǎng)法就顯得費(fèi)力些。此時(shí)可以可以通過(guò)細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)測(cè)量 T 細(xì)胞的反應(yīng)，即：ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)）進(jìn)行檢測(cè)。

方法步驟如下：在使用非反應(yīng)性血清進(jìn)行封閉之前，可以在 PVDF（聚偏二氟乙烯）覆蓋的微孔板上涂上單克隆或多克隆抗體，并將板上的 T 細(xì)胞與一種或多種物質(zhì)一起培養(yǎng)以激活細(xì)胞因子的分泌。然后細(xì)胞因子被包被的抗體捕獲。接下來(lái)，在添加二抗之前清洗板以去除碎片、未結(jié)合的抗體和培養(yǎng)基，二抗與顯色（著色）底物（通常是帶有辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的鏈霉親和素）偶聯(lián)，然后再次洗滌。然后，您可以將目的細(xì)胞因子視為可見(jiàn)點(diǎn)，并分別使用顯微鏡手動(dòng)或自動(dòng)使用自動(dòng)閱讀器對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。這種方法的缺點(diǎn)在于 雖然量化產(chǎn)生抗體的 T 細(xì)胞的數(shù)量方面相對(duì)較多，但在描述單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜時(shí)仍然受到限制。

3. 細(xì)胞內(nèi)染色

細(xì)胞內(nèi)染色是指在固定和透化細(xì)胞之前用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（例如莫能菌素或布雷菲爾德菌素）處理來(lái)抑制細(xì)胞因子的分泌，并針對(duì)您的細(xì)胞因子的熒光標(biāo)記抗體，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)量的方法。其缺點(diǎn)在于會(huì)殺死細(xì)胞 。

4. 細(xì)胞因子捕獲

細(xì)胞因子捕獲法的原理是來(lái)自不同抗體的兩個(gè)重鏈和輕鏈對(duì)組合在一起，得到帶有兩個(gè)不同配體的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的雜交抗體。這些雙特異性抗體可用于檢測(cè)細(xì)胞因子。一種配體是 T 細(xì)胞特異的標(biāo)記物，另一種是目標(biāo)細(xì)胞因子特異的標(biāo)記物。活化的 T 細(xì)胞用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑處理，因此細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)積累。然后使用雜交抗體來(lái)捕獲和檢測(cè) T 細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞因子。甲雜交抗體可用于執(zhí)行此操作。雜交抗體由對(duì)目標(biāo)細(xì)胞因子和常見(jiàn)細(xì)胞表面蛋白（如 MHC I 類）特異的抗體制成。雜交抗體結(jié)合活化的 T 細(xì)胞。如果 T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，則與細(xì)胞表面結(jié)合的雜交抗體會(huì)捕獲它們。然后使用針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞因子的標(biāo)記二抗檢測(cè)分泌細(xì)胞因子的 T 細(xì)胞。

5. 四聚體染色

T 細(xì)胞反應(yīng)也可以通過(guò)其受體的特異性來(lái)測(cè)量，使用熒光標(biāo)記的四聚體或特定的 MHC：肽復(fù)合物。MHC ：肽四聚體由重組 MHC 分子制成，其中特定肽與生物素-鏈霉親和素結(jié)合。表達(dá)相應(yīng)特異性的 T 細(xì)胞結(jié)合這些四聚體。然后對(duì)這些進(jìn)行染色以進(jìn)行檢測(cè)，并可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析！

6. 光譜分析和生物傳感器檢測(cè)

T細(xì)胞群的多樣性可以通過(guò)光譜分析來(lái)定義。在這里，CDR3 區(qū)域通過(guò)凝膠電泳可視化，讓您可以比較表達(dá)相同 V 段的受體。然后可以使用生物傳感器測(cè)定來(lái)測(cè)量配體與其互補(bǔ)抗原受體的結(jié)合和解離率。

待測(cè)配體固定在鍍金表面。然后使可溶性 T 細(xì)胞受體與結(jié)合的配體接觸并結(jié)合。一段時(shí)間后，他們分離。可以使用生物傳感器實(shí)時(shí)測(cè)量發(fā)生這種情況的速率。附著和脫離的速率由生物傳感器監(jiān)測(cè)，該生物傳感器可以有效進(jìn)行全內(nèi)反射并 結(jié)合對(duì)玻璃芯片表面偏振光源的影響來(lái)測(cè)量鍍金玻璃芯片表面分子的結(jié)合. 它檢測(cè)反射光束的角度和強(qiáng)度的任何波動(dòng)，并將其與時(shí)間繪制成圖以創(chuàng)建“傳感圖” 。

也可以結(jié)合受體而不是配體。當(dāng)系統(tǒng)飽和或達(dá)到結(jié)合和解離之間的平衡狀態(tài)時(shí)，達(dá)到最大結(jié)合后，曲線將趨于穩(wěn)定，表明不再發(fā)生結(jié)合。然后可以洗掉未結(jié)合的分子，在繼續(xù)洗滌后，它們都開(kāi)始從它們結(jié)合的蛋白質(zhì)上脫落。測(cè)量相互作用的曲線將開(kāi)始下降，顯示發(fā)生解離的速率。

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