單細胞技術(shù)主要研究內(nèi)容主要有：單細胞運動，單細胞生化活性，細胞牽引力等，單細胞技術(shù)研究方法有哪些？下面小編帶你一起來探尋。

細胞遷移運動的研究方法

細胞遷移在許多動態(tài)過程中至關(guān)重要，例如血管生成、胚胎發(fā)育、傷口愈合和疾病進展。如前所述，當(dāng)前的大部分知識體系都是從總體研究中產(chǎn)生的。然而，就細胞運動而言，只有選定的細胞才能進行自由運動，并且通常由單個細胞引導(dǎo)，充當(dāng)向?qū)?。還表明，單細胞遷移模擬 3D 環(huán)境中的細胞運動。

圖 1. 1D 單細胞遷移研究使用微接觸印刷軌道讓細胞附著并沿其移動 (A)。另一種方法是懸浮單根纖維狀纖連蛋白（任何纖維狀基質(zhì)蛋白都可以），為細胞附著和遷移創(chuàng)造一個偽 3D 環(huán)境 (B)。

   有幾種方法可以研究單細胞遷移。一種流行的方法是使用微接觸印刷區(qū)域來創(chuàng)建“細胞軌跡”。這種方法可以輕松探索遷移的幾何限制。印刷區(qū)域可以具有多種形狀和圖案，以嚴格控制和探索廣泛的條件（圖 1A）。1D 軌跡研究已經(jīng)完成，表明細胞呈現(xiàn)出與天然 3D 基質(zhì)中的細胞非常相似的獨特形態(tài)和表型。為了充分探索這一現(xiàn)象，研究人員通過顯微打印創(chuàng)建了不同厚度的“軌跡”，然后涂上基質(zhì)蛋白纖連蛋白 (Fn) 。這一觀察結(jié)果在其他研究中得到了概括，包括在偽 3D 環(huán)境中對 Fn 的單纖維進行的研究（圖 1B）。單纖維研究利用內(nèi)皮細胞，并證明了不同機械應(yīng)變纖維的明顯細胞附著和遷移差異。尖端細胞遵循 Fn 初步矩陣在血管生成和血管生成中創(chuàng)建血管系統(tǒng)。在傷口愈合、疾病進展和發(fā)展的動態(tài)過程中，接受營養(yǎng)和其他關(guān)鍵生物成分的能力是必不可少的。 在單細胞遷移中的這一發(fā)現(xiàn)提出了與所有這些過程相關(guān)的定向遷移理論，以及由于 Fn中的配體密度而對 durotaxis 的機械洞察力。

  通過利用微流體平臺運行不同種類的單細胞遷移測定。創(chuàng)建通道系統(tǒng)，細胞被困在某些區(qū)域，然后允許遷移穿過一部分。這些系統(tǒng)不僅過濾細胞，還允許遷移檢查。已經(jīng)在該系統(tǒng)內(nèi)進行了癌癥研究，以確定癌細胞遷移能力的差異，以檢查轉(zhuǎn)移的根本原因。此外，該系統(tǒng)還有一個額外的好處，即能夠探索定向遷移，例如趨化性，還可以進一步檢查具有遷移能力的細胞，以發(fā)現(xiàn)其他關(guān)鍵差異。已經(jīng)表明，與非轉(zhuǎn)移細胞相比，轉(zhuǎn)移細胞對趨化梯度的反應(yīng)更大，并且顯示出較更高水平的 GTP 酶標(biāo)記物。

跟蹤細胞遷移的傳統(tǒng)方法也可以應(yīng)用于單個細胞。單細胞遷移的關(guān)鍵因素是起初減少細胞與細胞的接觸。這可以通過將低密度的細胞電鍍到涂層表面來實現(xiàn)的。選擇用于涂覆表面的分子取決于研究參數(shù)，就像體遷移研究一樣。由于細胞傾向于粘附，因此必須進行徹底的篩選過程，以確保選定的遷移細胞具有相關(guān)且具有代表性的表型。

圖 2. FRET 生物傳感器通過將供體和受體熒光團連接到感興趣的分子來發(fā)揮作用。當(dāng)分子相互作用并且供體足夠接近以激發(fā)受體熒光團時，就會發(fā)生 FRET。這導(dǎo)致強度信號從完全供體轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆荏w。

單細胞技術(shù)中的3D 遷移是一種較容易采用的技術(shù)，因為它結(jié)合了單細胞分析的特點，同時將細胞置于與其原生環(huán)境非常相似的環(huán)境中。膠原蛋白 3D 基質(zhì)現(xiàn)在可以在大多數(shù)實驗室中輕松生產(chǎn)，這使得這些研究比以前在基質(zhì)凝膠上進行的研究較容易獲得。盡管 2D 和 3D 遷移之間的運動有相似之處，但正在生成更全面的細胞運動圖像。細胞通過肌動蛋白聚合在 2D 中遷移，從而產(chǎn)生具有片狀偽足的前沿和滯后邊緣。然而，在 3D 中，有幾種遷移模式取決于前緣形狀和細胞-基質(zhì)粘附。此外，即使在 3D 中，細胞也會繼續(xù)對基質(zhì)的機械特性做出反應(yīng)。2D 和 3D 遷移之間有明顯的相似之處，但環(huán)境更加復(fù)雜和動態(tài)，導(dǎo)致遷移趨勢多種多樣。3D 遷移的比較大的挑戰(zhàn)之一是使用顯微鏡可視化該過程以收集相關(guān)數(shù)據(jù)，但先進的成像技術(shù)和計算機算法使其成為可能。

圖 3.細胞牽引力通過細胞附著和變形支柱 (A) 或 Fn 涂層水凝膠 (B) 來計算。

生化活性測定

在單細胞技術(shù)水平研究生物過程可以擴展許多以前的知識庫，方法是識別通常通過分析大量大細胞群而模糊的關(guān)鍵差異。然而，單細胞技術(shù)也適用于研究導(dǎo)致和驅(qū)動這些過程的根生化活動。Forester 或熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 是能量從供體到受體熒光團的無輻射轉(zhuǎn)移 。轉(zhuǎn)移依賴于鄰近性，并且僅當(dāng)兩個相應(yīng)的熒光團相距 1 到 10 納米時才會發(fā)生。在這些距離內(nèi)，激發(fā)（供體）熒光團發(fā)射一個虛擬質(zhì)子，該質(zhì)子被接收（受體）熒光團吸收，引起相應(yīng)的激發(fā)。因此，結(jié)果被解釋為受體熒光的函數(shù)（圖 2）。FRET 允許對遠低于傳統(tǒng)顯微鏡分辨率的生物現(xiàn)象進行可視化 。多種分子可以與供體和受體熒光團結(jié)合，使 FRET 能夠探測許多生物過程。FRET 已成功用于探測蛋白質(zhì)折疊和構(gòu)象、DNA-DNA/RNA 相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和配體-受體結(jié)合 。FRET 系統(tǒng)通常被稱為生物傳感器，除了能夠獨立生產(chǎn)新的傳感器之外，現(xiàn)在還可以直接通過商業(yè)的方式獲得。

生物傳感器用于較多地了解 GTP 酶的作用。使用多個 FRET 傳感器產(chǎn)生了傳統(tǒng)生化方法無法獲得的時空 GTPase 活性數(shù)據(jù)。通過這些信息可以了解遷移以及與 GTPase Rho、Rac 和 Cyc42 的關(guān)系。已確定 Rac 對細胞遷移初始階段前沿的細胞伸長比較重要，而 Rho 和 Cyc42 對滯后端的回縮也重要。

細胞牽引力的測定

細胞牽引力 (CTF) 是許多生物過程（如遷移）的驅(qū)動力。作為細胞運動的調(diào)節(jié)劑，它們在血管生成和血管發(fā)生、發(fā)育、傷口愈合和疾病進展等動態(tài)過程中有著重要作用。細胞產(chǎn)生的機械力也有助于通過涉及機械信號的反饋回路調(diào)節(jié)細胞形狀和體內(nèi)平衡。細胞通過附著點產(chǎn)生牽引力到稱為粘著斑的細胞外基質(zhì)。當(dāng)施加力時，它會導(dǎo)致 ECM 發(fā)生變化，通過這種粘附感測到，并導(dǎo)致細胞發(fā)生相應(yīng)的變化。細胞也可以通過這些力相互作用。

CTF 的測量需要三個步驟：打印力陣列、零力陣列測量和施力陣列測量。CTF 測量的主要方法是將小柱打印到柔性聚丙烯酰胺凝膠 (PG) 上，并用細胞外基質(zhì)蛋白涂覆它們以形成粘著斑 (圖 3A)。這些支柱起到懸臂的作用，變形或彎曲它們所需的力可以通過支柱的已知物理特征來計算。支柱的參數(shù)和它們印刷的圖案是根據(jù)相關(guān)應(yīng)用確定的。參數(shù)的變化已被用于確定粘著斑數(shù)量對 CTF的影響。

細胞外基質(zhì)蛋白可以直接打印到靈活的 PG 表面（圖 3B）。與柱子一樣控制間距和圖案。該系統(tǒng)的優(yōu)點是可以以不同的分布和模式打印多種蛋白質(zhì)，以探索基于粘附基材的 CTF 的差異。這種方法已經(jīng)證明，細胞遷移與 Fn 形成粘著斑，而不是白蛋白或?qū)诱尺B蛋白。此外，這項技術(shù)還提供了 CTF 的實時分析，并可以同時確定電池的機械性能。

CTF 提供了對粘附和遷移過程的機械洞察。內(nèi)皮細胞 CTF 的研究證實了細胞遷移的滯后模型，并且還表明細胞運動取決于細胞附著點的密度。形態(tài)也受到細胞粘附和 CTF 的影響，導(dǎo)致細胞呈現(xiàn)出與粘著斑數(shù)相關(guān)的不同表型。對細胞遷移機制的透徹理解主要應(yīng)用于傷口愈合、轉(zhuǎn)移和細胞發(fā)育研究中。

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