細胞和CAR-T有望徹底改變醫(yī)藥保健，但這些產(chǎn)品的制造對質(zhì)量和安全保證策略提出了新的挑戰(zhàn)。在支原體檢測時尤其如此，支原體是一種無處不在且?guī)缀蹩床灰姷募毎囵B(yǎng)細菌污染。這些挑戰(zhàn)是 2019 年 PharmaLab 支原體 qPCR 檢測會前研討會上演講的共同主題，特別是考慮到歐洲藥典第 2.6.7 章的預(yù)期修訂。共識點包括，使用細胞基質(zhì)進行測試的重要性以及將 NAT 定位為快速第一線檢測的實施策略的潛力，然后通過基于培養(yǎng)的藥典方法進行結(jié)果驗證。

支原體檢測常見問題解答

1. 基于基因、細胞和組織的先進產(chǎn)業(yè)藥物 (ATMP) 如何給支原體檢測帶來挑戰(zhàn)？ 

生物制藥支原體檢測的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是周轉(zhuǎn)時間，因為生產(chǎn)延遲可能代價高昂，并且會限制急需藥物的供應(yīng)。這項挑戰(zhàn)源于常用的“經(jīng)典”藥典方法，這些方法以文化為基礎(chǔ)，需要數(shù)周時間才能產(chǎn)生結(jié)果。對更快地檢測支原體的需求以及監(jiān)管機構(gòu)對替代檢測方法的接受使核酸擴增技術(shù) (NAT) 成為人們關(guān)注的焦點。NAT 可以通過聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 檢測支原體 DNA 的存在，從而將獲得結(jié)果的時間從幾周縮短到幾小時。

然而，周轉(zhuǎn)時間只是冰山一角。在實施基于 NAT 的方法以確保產(chǎn)品安全時，其他考慮因素也很重要。由于 ATMP 廣泛多樣， 隨著進一步的創(chuàng)新擴大了 ATMP 的方法和應(yīng)用范圍，這種多樣性也將隨著時間的推移而增加。

2.制造過程中的哪些階段是合適的測試點？

經(jīng)驗表明，并非生物藥物或 ATMP 生產(chǎn)中的所有時間點都適合支原體檢測。應(yīng)根據(jù)支原體污染風(fēng)險最高的點來選擇檢測點。對于 ATMP，除了用于發(fā)布測試的預(yù)處理收獲之外，還應(yīng)評估過程中的測試點以包括在內(nèi)，例如在幾代之后測試源材料或初始細胞起始材料。

3.哪些樣品類型適合支原體檢測？

培養(yǎng)上清液或其他無細胞基質(zhì)可能不足以進行檢測，因為支原體通常會附著甚至侵入細胞。顯然，樣本選擇是經(jīng)過驗證的測試策略的關(guān)鍵參數(shù)。此外，需要仔細考慮測試前的樣品制備步驟，以確保用于測試的樣品類型仍能代表產(chǎn)品。因此，建議避免或完全證明無細胞基質(zhì)是合理的。事實上，大多數(shù)商業(yè)測試開發(fā)人員都在轉(zhuǎn)向細胞矩陣，并尋找方法來克服由高細胞數(shù)引起的技術(shù)障礙。

4.您如何構(gòu)建符合法規(guī)要求的簡化驗證設(shè)計？

從驗證的角度來看，必須使用復(fù)雜的樣本 Christiana Schnitzler 曾在演講中提到過，她正在領(lǐng)導(dǎo) Boehringer Ingelheim 的一個團隊對 Roche CustomBiotech 的 MycoTOOL 支原體實時 PCR 試劑盒進行通用驗證。該試劑盒設(shè)計用于處理天然樣品，Schnitzler 正在檢查該檢測方法是否對 PCR 抑制劑、DNA 提取變異以及試劑和樣品處理具有穩(wěn)健性。她的目標(biāo)是證明該檢測的靈敏度至少與“經(jīng)典”藥典方法相當(dāng)。該團隊關(guān)于檢測限的數(shù)據(jù)仍在收集中，但初步結(jié)果表明，十種測試的支原體可以達到法規(guī)要求的靈敏度（≤10 CFU/mL）。 

      Schnitzler 的實施方法將測定驗證與可比性研究相結(jié)合，以確定 PCR 方法是否與“經(jīng)典”藥典培養(yǎng)和指示細胞培養(yǎng)方法一樣靈敏、特異和穩(wěn)健。在這一點上，只有在可以證明這種等效性的情況下，起始基于 NAT 的方法才能替代更費力、樣本密集和冗長的金標(biāo)準(zhǔn)方法。羅氏制藥多年來一直在其生產(chǎn)車間使用其 MycoTOOL 支原體實時 PCR 解決方案，并利用基于培養(yǎng)的方法進行驗證。

5.您如何將基于 NAT 的方法實施到流程工作流中？

  基于 NAT 的商業(yè)支原體測試提供了優(yōu)化的檢測架構(gòu)的便利性，具有廣泛的物種覆蓋和高靈敏度，以及高通量測試和自動化的選項。

  幾位演示者分享了對市場測試的評估和經(jīng)驗教訓(xùn)，這些經(jīng)驗教訓(xùn)可以使其他人更容易實施基于 NAT 的方法。例如，盧布爾雅那大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)和免疫學(xué)研究所的 Andrej Steyer 強調(diào)需要具有低基因組拷貝與 CFU 比率 (GC:CFU) 且特征明確的驗證標(biāo)準(zhǔn)。

  Steyer 比較了 SYBR Green 支原體檢測和基于探針的 MycoTOOL 支原體實時 PCR 試劑盒。Steyer 選擇專注于基于探針的試劑盒，因為它表現(xiàn)出更好的靈敏度和 CT 值的可變性更小，Steyer 檢查了它在兩個不同的循環(huán)儀和自動 DNA 提取上的性能。研究中使用的兩種支原體參考標(biāo)準(zhǔn)之間的 GC:CFU 比率有十倍的差異再次出現(xiàn)在所得的 PCR 和測序數(shù)據(jù)中。Steyer 建議“牢記支原體參考標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量及其可能產(chǎn)生的影響?！?

6.歐洲藥典第 2.6.7 章的預(yù)期修訂對使用基于 NAT 的支原體檢測方法有何影響？

實施基于 NAT 的支原體檢測方法需要全面驗證和證明性能至少與“經(jīng)典”藥典方法相當(dāng)。研討會上討論的主題強調(diào)了在驗證和實施基于 NAT 的方法方面需要更詳細的指導(dǎo)。但是，必須確保具體建議不會分散制定與未來產(chǎn)品相關(guān)的指南的注意力。 

  現(xiàn)有基于 PCR 的支原體檢測的物種覆蓋范圍相當(dāng)全面。例如，MycoTOOL 支原體實時 PCR 試劑盒理論上可覆蓋大約 150 種可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的菌株。這種廣泛的覆蓋范圍可用于通用驗證。其中，維也納獸醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)研究所教授 Renate Rosengarten 教授和 Mycosafe Consulting 主任建議擴大使用基于 NAT 的方法進行測試所需的支原體物種清單，以便根據(jù)產(chǎn)品相關(guān)性進行選擇基于風(fēng)險評估確定的潛在進入后的增長能力。

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