感受態(tài)細(xì)胞也能diy ?

標(biāo)簽：感受態(tài)細(xì)胞   細(xì)胞膜 科普  離心管 

感受態(tài)細(xì)胞是分子蛋白生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的一種菌株。常見的感受態(tài)有：用于藍(lán)白斑篩選鑒別的DH5a；用于表達(dá)毒性或非毒性蛋白的BL21菌株；用于 DNA及質(zhì)粒克隆的TOP10菌株等。但是你知道嗎？其實(shí)感受態(tài)細(xì)胞也能DIY ，小編就帶領(lǐng)大家了解一下吧，動(dòng)手能力強(qiáng)的小伙伴也可以試試噢。

一、化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備原理

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞基本上是經(jīng)過化學(xué)處理的細(xì)菌，使細(xì)菌能夠在情況需要時(shí)，吸收外源質(zhì)粒 DNA。當(dāng)大腸桿菌的細(xì)胞膜被激活使質(zhì)?？梢暂p松 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，這種吸收外源DNA的狀態(tài)稱為能力，化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞主要是通過熱休克 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

上圖中我們看出：

圖A中的細(xì)胞膜完整，外源DNA無法滲透；

圖B中的細(xì)胞通過處理，細(xì)胞膜通透性，外源DNA可以滲透；

要制備具有化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，需要培養(yǎng)一批大腸桿菌并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。然后，在大腸桿菌生長的對(duì)數(shù)增長進(jìn)行收集，成為制備感受態(tài)細(xì)胞的原材料。因此，在對(duì)數(shù)生長期收集細(xì)胞至關(guān)重要。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，由于是不添加抗生素的，所以我們需要注意無菌操作，謹(jǐn)防感染。細(xì)胞收獲后，含有 15 % v/v甘油 ，濃度為 100 mM的 CaCl 2緩沖液進(jìn)行處理，使膜對(duì)質(zhì)粒 DNA 具有半滲透性。

完成之后，將細(xì)胞分裝出來，置于在 -80 °C下冷凍即可。冷凍時(shí)注意加入定量的甘油成分，防止凍傷細(xì)胞。

二、制備前的準(zhǔn)備：

1.在 LB 肉湯中生長的大腸桿菌菌株的新鮮過夜培養(yǎng)物。

2.進(jìn)口的無菌離心管。

3.用于讀取大腸桿菌光密度的光譜儀。

4.含有 15 % v/v 甘油的 CaCl 2，濃度為 100 mM 。。

5.可耐-80°C以下環(huán)境的離心管或凍存管。

三、感受態(tài)細(xì)胞DIY實(shí)驗(yàn)步驟

1.接種目的大腸桿菌菌株在 10 mL 的無菌 LB培養(yǎng)基中。于 37°C 下培養(yǎng)過夜，以 200 rpm 的速度搖晃。

2.將 1 mL 的過夜培養(yǎng)物重新接種到 99 mL 的無菌 LB 中，并在 37°C 下以 200 rpm 的速度搖動(dòng)，直到達(dá)到 600 nm （OD 600）的光密度為 0.3 – 0.5（對(duì)數(shù)中期）。

3.將 100 mL 培養(yǎng)物平均分配在無菌離心管之間，并在 4 °C 下以 ~ 7000 rpm 離心 10 分鐘收集細(xì)胞。丟棄上清液并使用瑞寧移液器去除殘留的任何液滴。

4.將 20 mL ， 100 mM的無菌 CaCl 2溶液  添加到細(xì)胞中，并輕輕地重新懸浮細(xì)胞。

5.在 4°C 下以  7000 rpm 左右的冷凍離心機(jī)離心 10 分鐘左右，收集洗滌過的細(xì)胞并丟棄上清液。

6.加入 5 mL ，100 mM 的無菌CaCl 2，并輔以 15% v/v 甘油，然后輕輕地?fù)u勻，使其重新懸浮。

7.用耐凍的離心管進(jìn)行分裝，每管的分裝量以50 μL aliquits為宜。

8.將制備好的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞儲(chǔ)存在-80°C環(huán)境中。效期約為1 年。

實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)：

在進(jìn)行感受態(tài)制備的過程中需要注意以下幾點(diǎn)：

由于具有化學(xué)活性的細(xì)胞失去細(xì)胞膜屏障，比較脆弱，所以在對(duì)大腸桿菌進(jìn)行處理時(shí)需要輕柔對(duì)待。

由于培養(yǎng)物中不含抗生素，所以無菌操作很重要，尤其在進(jìn)行細(xì)胞的OD 600檢查時(shí)。

在為整個(gè)實(shí)驗(yàn)室組制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，需要進(jìn)行分裝登記并做好標(biāo)識(shí)，置于-80以下環(huán)境中保存。

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