17年專注生物實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備&耗材綜合供應(yīng)
0512-6295610418934597460
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1 -戴干凈的手套；
2 -用75%酒精清洗移液管和支架；
3 -解凍DNA樣本和所有試劑（（2×TaqMan基因表達(dá)主混合液（Applied BioSystems）、引物（10 μM）和探針（10 μM）)；
4 -輕輕混合DNA樣品，并在渦旋器上充分混合試劑。
5 -用離心機(jī)對DNA樣品和試劑進(jìn)行離心； 6 -試劑置于冰上；
7 -標(biāo)記微管，使其準(zhǔn)備好用于混合物的制備。
8 -所需設(shè)備：ABI Step One Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied BioSystems） 9 -所需耗材：96孔板（100ul）
反應(yīng)設(shè)置
1 -根據(jù)表1中的指南，制備所需反應(yīng)次數(shù)的反應(yīng)混合物。組裝除樣品外的 所有所需組件，將等量的樣品分配到每個(gè)反應(yīng)孔中，并在最后一步向每個(gè)反應(yīng) 管中加入樣品。
表1.反應(yīng)混合物的制備。
|
組件 |
每次反應(yīng)的體積， μ l |
規(guī)格 |
|
2×TaqMan基因表達(dá)Master Mix |
10 |
1 × |
|
（10 μM）正向引物 |
1.8 |
900nM |
|
（10 μM）反向引物 |
1.8 |
900nM |
|
（10 μM）探頭 |
0.5 |
250nM |
|
樣本DNA |
4 |
|
|
無RNase/DNase的水 |
1.9 |
|
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總量 |
20 |
|
2 -在旋渦中充分混合平板，然后短暫離心。
熱循環(huán)條件
對于朗基熒光定量 PCR 儀，熱循環(huán)條件補(bǔ)充如下：
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溫度（℃） |
時(shí)間 |
循環(huán)次數(shù) |
|
50 |
2 min |
1 |
|
95 |
10 min |
1 |
|
95 |
15 sec |
40 |
|
60 |
60 sec |
40 |
使用朗基熒光定量 PCR 儀配套的分析軟件（具體版本以儀器實(shí)際配置為準(zhǔn)）分析熒光累積數(shù)據(jù)。操作時(shí)，可先將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件，通過設(shè)置基線范圍、閾值等參數(shù)，軟件會自動(dòng)識別熒光信號的變化趨勢，進(jìn)而完成對目標(biāo)基因的定量分析（如計(jì)算 Ct 值、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線等）。
詳細(xì)操作可參照朗基熒光定量 PCR 儀的用戶手冊，以確保參數(shù)設(shè)置符合實(shí)驗(yàn)要求，獲得準(zhǔn)確的分析結(jié)果。
蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司成立于2008年，位于蘇州園區(qū)生物納米園（Biobay）A5幢301室。公司管理團(tuán)隊(duì)專注于科學(xué)儀器行業(yè)十四年，擁有專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)與完善的售后服務(wù)體系，目前已為300余家實(shí)驗(yàn)室提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)，涵蓋各大高校、檢測中心、科研機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)等13個(gè)群體。提供的實(shí)驗(yàn)室儀器主要包括振蕩培養(yǎng)箱，恒溫恒濕培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀，瑞寧移液器，生物反應(yīng)器，發(fā)酵罐，超低溫冰箱，液氮罐，高壓滅菌器，超純水機(jī)，天平，離心機(jī)，離心濃縮儀、研磨機(jī)、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業(yè)授權(quán)包括知楚儀器、朗基、中科美菱，梅特勒，樂楓，搏旅、NEST、天根、奧盛在內(nèi)的80個(gè)余廠家。
本文標(biāo)簽： QPCR 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 核酸提取 反應(yīng)體系配置
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