蛋白免疫印跡技術（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。蛋白免疫 印跡技術主要用于檢測或分析蛋白，例如用酵母表達某種目的蛋白，把基因克隆到宿主后，要檢測目的蛋白的表達就可以用western blot。

蛋白質印跡技術背景

20 世紀 70 年代，Southern 教授發(fā)明了檢測 DNA 的方法，命名為 Southern blot。之后，隨著技術的發(fā)展，另一位科學家發(fā)明了檢測 RNA 的方法，由于其與 DNA 檢測相對應，被稱為 Northern 印跡技術。在這些技術的基礎上，蛋白免疫印跡技術 Western blot 逐漸發(fā)展起來。它借鑒了前兩者的原理，用于檢測和分析蛋白質，成為分子生物學等領域的重要工具。

一、蛋白電泳：目前最常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），在這一步蛋白質會根據(jù)分子量大小分開，分子量小的會在膠的底部，分子量大的會在膠的頂部。

SDS也就是十二烷基硫酸鈉是帶負點的，它可以消除蛋白質的電荷差異，只保留大小差異，使其都帶上負電，從而能在電場的作用下遷移。

二、轉膜：此步驟主要是將蛋白質從凝膠轉移到膜上，常用的是硝酸纖維素膜和PVDF（聚偏氟乙烯），膜具有與蛋白質高度親和的能力，也就是說更容易與蛋白結合。

為什么要將蛋白從膠上轉移到膜上進行檢測呢？因為蛋白電泳時位于膠的內部，而轉移到膜上位于膜的表面，更容易與之后的抗體結合。

那么如何將蛋白質從膠轉移到膜上呢？

    之前提到過蛋白質在電泳作用下已經(jīng)帶上了負電，那么我們只需要在膠和膜的外面外加一個電場，蛋白就會向膜上移動了。具體操作需要先做一個“三明治”，海綿墊、濾紙、膜、膠、濾紙、海綿墊（見圖），濾紙的作用是維持穩(wěn)定的流動，而海綿墊則對整個系統(tǒng)起到穩(wěn)定的作用。

 然后將膜放在靠近正極的一側后我們將它放入轉膜槽進行轉膜，過程中我們會加入甲醇，由于甲醇可以使蛋白質與SDS分離，加入甲醇可以使蛋白質更好的結合膜。

三、封閉：前面提到膜與蛋白質具有高度親和的能力，所以我們必須封閉空白著的結合位點，防止之后加的抗體與膜直接結合，也稱阻止非特異性結合。通常我們會用脫脂牛奶或者牛血清蛋白（BSA）作為緩沖液。

四：加抗體：一般先加第一抗體，一抗可以和我們的蛋白質特異性結合，之后需要洗幾遍膜，將未結合的一抗洗掉，下一步加入第二抗體檢測，二抗是被標記了的抗體，可以與一抗特異性結合，一個一抗可以和兩個甚至更多的二抗結合，放大檢測信號，同樣二抗孵育完也要把未結合的二抗洗去。

五、檢測：二抗通常會用堿性磷酸化酶或辣根過氧化物酶（HRP）標記，最后當我們加入底物時，HRP就會引起化學發(fā)光，從而使我們能夠看到目的條帶。而后用膠片曝光就得到了最終結果。

蛋白免疫印跡技術注意事項

 ? 轉膜時濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

 ? 轉膜時間一般為1.5 小時，需要根據(jù)分子量大小調整轉膜時間和電流大小。

 ? 為避免出現(xiàn)信號低的情況，可以選用高靈敏度的發(fā)光液，如ECL發(fā)光液等。  

Western blot蛋白免疫印跡技術不僅是大部分實驗的重要基礎，更是醫(yī)學領域中常見的實驗技術。因其操作原理與眾多實驗具有相似性，所以扎實掌握這一技術，對其他實驗技術的學習也大有裨益。更多電泳儀，電泳槽，化學發(fā)光成像儀，凝膠成像儀等Western blot實驗室儀器，實驗耗材以及生物試劑可以進入蘇州阿爾法生物網(wǎng)站進行了解， 0512-62956104或18934597460.

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