培養(yǎng)參數(shù)會(huì)影響 CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)、重組蛋白表達(dá)、蛋白糖基化、細(xì)胞代謝物和其他因素。生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)用于在 CHO 細(xì)胞中培養(yǎng)用于 RTP 生產(chǎn)的懸浮培養(yǎng)物。細(xì)胞通過CO2振蕩搖床、搖瓶、滾瓶擴(kuò)增后，接種在生物反應(yīng)器中進(jìn)行傳代生長(zhǎng)。對(duì)于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)通常通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 或一次單因素 (OFAT) 研究進(jìn)行優(yōu)化，這些優(yōu)化包括溫度、溶解氧 (DO) 、滲透壓和 pH 值等。

一、培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)降溫一般在指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。為了減少細(xì)胞凋亡和促進(jìn)抗體合成，將培養(yǎng)溫度從 37 ℃ 切換到 29 ℃ 至 35 ℃ 的較低溫度。低溫對(duì)完整細(xì)胞密度、細(xì)胞活力和細(xì)胞比生產(chǎn)力具有積極影響。比如：使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程培養(yǎng)表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素 (hEPO) 的 CHO 細(xì)胞時(shí)，低溫不僅有利于提高CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的比生產(chǎn)力，而且顯著增加了編碼未折疊蛋白反應(yīng)特異性轉(zhuǎn)錄激活因子的基因，降低了蛋白降解的可能性；低溫還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)增強(qiáng) hEPO 的表達(dá). 

細(xì)胞培養(yǎng)溫度可以影響 CHO 細(xì)胞中的 VCD 和蛋白質(zhì)表達(dá)。當(dāng)表達(dá)抗 CD20 mAb 的 CHO 細(xì)胞在 35 °C、33 °C 和 31 °C 下培養(yǎng)并在第 3、6 和 9 天添加補(bǔ)料培養(yǎng)基時(shí)，35 °C 可以增加細(xì)胞密度和抗- CD20 單克隆抗體。生產(chǎn)中也會(huì)使用通過低溫條件上調(diào)與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和 CHO 細(xì)胞中 miRNA 表達(dá)的方法來(lái)增加 IgG 的產(chǎn)生。因此，低溫是細(xì)胞培養(yǎng)正常的因素之一。

二、滲透壓

在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)后期，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和代謝副產(chǎn)物積累能夠增加細(xì)胞外滲透壓。補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和堿都可以增加培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓。在補(bǔ)料分批過程中，NaCl 保持高滲透壓。它增加了 mAb 的滴度，減少了半乳糖基化，并增加了高甘露糖糖基化的比例 。連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致重量克分子滲透壓濃度低于 450 mOsm/kg 可將高甘露糖糖基化降低至低于 5%，并將單克隆抗體的產(chǎn)量提高至 10 g/L。

實(shí)驗(yàn)證明：高滲透壓對(duì) CHO 細(xì)胞中蛋白質(zhì)糖基化是有影響的。比如：添加甜菜堿后滲透壓達(dá)到 400 mOsm /kg 以上，CHO 細(xì)胞中的 Fc 融合蛋白唾液酸化減少。無(wú)機(jī)鹽和高進(jìn)料量會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的高滲透壓。盡管高滲透壓提高了細(xì)胞特異性生產(chǎn)力對(duì)CHO細(xì)胞的影響,但增加高甘露糖的比例可以抑制CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)。科學(xué)家曾對(duì)高滲透壓暴露的 CHO 細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并分別在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的第 2 天、第 6 天和第 8 天采集細(xì)胞樣本。通過蛋白質(zhì)印跡分析在第 2、6 和 8 天取樣的高滲透壓暴露細(xì)胞組和對(duì)照細(xì)胞組的全蛋白裂解物。Septins 蛋白在高滲處理后第 6 天上調(diào)約 2-3 倍，在第 8 天上調(diào)約 1-3 倍。將 CHO 細(xì)胞暴露于高度濃縮的補(bǔ)料培養(yǎng)基會(huì)導(dǎo)致滲透壓在細(xì)胞生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和蛋白質(zhì)組方面增加超過 300 mOsm/kg。因此，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，適當(dāng)?shù)奶砑觿┛梢垣@得適宜的滲透壓。

三、酸堿度

細(xì)胞培養(yǎng)物的 pH 值需要優(yōu)化才能產(chǎn)生高質(zhì)量的重組蛋白。CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)的 pH 范圍為 7.2 至 7.6之間。表達(dá)抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-MA）mAb的CHO細(xì)胞在3L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，并優(yōu)化培養(yǎng)條件。通過加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。當(dāng)pH值設(shè)置為7.10時(shí)，VEGF-MA的產(chǎn)量增加到4.1 g/L，電荷異質(zhì)性、糖基化水平和蛋白質(zhì)純度分別為26.1%、59.1%和95.1%。 在設(shè)計(jì)補(bǔ)料分批培養(yǎng)的 pH 值時(shí)，必須遵循 CHO 細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn) pH 值范圍。如果細(xì)胞培養(yǎng)物的 pH 值保持在 6.8 以下或 7.6 以上，CHO 細(xì)胞的生長(zhǎng)就會(huì)受到負(fù)面影響。細(xì)胞培養(yǎng)物的pH通常由CO 2和無(wú)機(jī)鹽相互作用調(diào)節(jié)，以促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。

四、溶解氧

DO 是大規(guī)模過程中的關(guān)鍵環(huán)境參數(shù)之一，它影響細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白生產(chǎn)。CHO 細(xì)胞中的大多數(shù) DO 值通常在 20% 到 50% 的范圍內(nèi)。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)模式下，當(dāng) DO 值為 20% 時(shí)，重組促甲狀腺激素 (rTSH) 的末終滴度為 1.6 mg/L. 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將 DO 值調(diào)整為 40%，表達(dá)人 IgG1 mAb 的 CHO 細(xì)胞在提供有乙酸銅和檸檬酸鐵的補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中培養(yǎng)。mAb 的產(chǎn)量在 14 天的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中達(dá)到 10 g/L 以上，乙酸銅和檸檬酸鐵減少了 man5 含量和 mAb 的酸性電荷變體，并增加了 G1F 的比例。

五、補(bǔ)料培養(yǎng)策略

    除了調(diào)整補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成和設(shè)置合理的工藝參數(shù)外，還需要設(shè)計(jì)和開發(fā)可用的補(bǔ)料策略以生產(chǎn)高產(chǎn)和高質(zhì)量的重組蛋白。在飼養(yǎng)策略方面應(yīng)考慮控制標(biāo)準(zhǔn)和補(bǔ)料方式。將一種或兩種主要營(yíng)養(yǎng)素的濃度保持在理想水平是通過控制標(biāo)準(zhǔn)完成的。根據(jù)化學(xué)計(jì)量飼料組成，將剩余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加到培養(yǎng)系統(tǒng)中。生物反應(yīng)器培養(yǎng)策略通常分為兩種添加方式：連續(xù)培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)。分批補(bǔ)料培養(yǎng)法具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。分批補(bǔ)料遞送策略增加了單克隆抗體在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)，是大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中使用較廣泛的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法。但是加入大量補(bǔ)料培養(yǎng)基會(huì)導(dǎo)致代謝副產(chǎn)物的積累和重量克分子滲透壓濃度的增加。而連續(xù)培養(yǎng)則可以根據(jù)養(yǎng)分消耗情況調(diào)整飼喂速度以維持養(yǎng)分濃度。因此，連續(xù)補(bǔ)料在細(xì)胞培養(yǎng)方面更具優(yōu)勢(shì)。

為了促進(jìn) CHO 細(xì)胞中抗 HER2 mAb 的高表達(dá)，在第 3、5、7 和 9 天添加 5% 的初始培養(yǎng)體積的補(bǔ)料。補(bǔ)料中的峰值 VCD 為 17.1 × 10 ⁶ 個(gè)細(xì)胞/mL。分批培養(yǎng)和 mAb 產(chǎn)量達(dá)到 437 mg/L。為了提高CHO細(xì)胞中人鼠嵌合抗表皮生長(zhǎng)因子受體變體III（EGFR vIII）抗體C12的表達(dá)，采用連續(xù)補(bǔ)料策略，從第3天開始向生物反應(yīng)器中加入補(bǔ)料培養(yǎng)基。與推注補(bǔ)料方法相比，連續(xù)補(bǔ)料法降低了細(xì)胞代謝副產(chǎn)物的比例、培養(yǎng)滲透壓和高甘露糖型，提高了CHO細(xì)胞的VCD和活力，抗體產(chǎn)量超過10 g/L。

使用連續(xù)補(bǔ)料優(yōu)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程來(lái)培養(yǎng) CHO 細(xì)胞。從第4天開始，補(bǔ)充濃度高于400 g/L的葡萄糖溶液，使最終葡萄糖濃度低于5.55 mmol/L。從第 5 天開始，連續(xù)添加含有絲氨酸的補(bǔ)料培養(yǎng)基。連續(xù)補(bǔ)料可降低細(xì)胞培養(yǎng)物的滲透壓和甘露糖基化率，但會(huì)增加 mAb 產(chǎn)量。如果CHO細(xì)胞的VCD和細(xì)胞活力在指數(shù)期晚期或穩(wěn)定期早期呈下降趨勢(shì)，則應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基。良好的進(jìn)料策略對(duì) RTP 生產(chǎn)有積極影響。

流加培養(yǎng)中引入監(jiān)測(cè)和控制系統(tǒng)，將關(guān)鍵細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素保持在理想水平。Bolus feed delivery strategy廣泛用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，但它不能根據(jù)細(xì)胞在不同代謝階段的動(dòng)態(tài)營(yíng)養(yǎng)消耗率調(diào)整培養(yǎng)基濃度。

六、補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的代謝副產(chǎn)物

在細(xì)胞培養(yǎng)的后期，補(bǔ)料分批培養(yǎng)通常會(huì)儲(chǔ)存乳酸和銨鹽等副產(chǎn)物。高濃度的代謝副產(chǎn)物不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)。CHO細(xì)胞中的葡萄糖通過糖酵解產(chǎn)生大量丙酮酸，部分丙酮酸使用乳酸脫氫酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸。如果培養(yǎng)中使用半乳糖作為碳源，可以相應(yīng)減少培養(yǎng)過程中的乳酸積累。

 實(shí)驗(yàn)證明，使用表達(dá)抗 HIV 抗體 VRC01 的 CHO-K1 細(xì)胞在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中培養(yǎng)。從第 3 天開始每天添加補(bǔ)料培養(yǎng)基。在細(xì)胞接種 12 小時(shí)后，將 10 mM 和 30 mM NH 4 Cl 添加到 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中。與對(duì)照組相比，30 mM NH 4 Cl處理組VCD和培養(yǎng)時(shí)間減少，乳酸、葡萄糖、銨和谷氨酰胺等副產(chǎn)物積累較多。特別是，銨對(duì)抗體滴度和細(xì)胞特異性生產(chǎn)力有負(fù)面影響.

 向 CHO 細(xì)胞中添加包括α-酮戊二酸 (α-KG)、蘋果酸和琥珀酸在內(nèi)的 TCA 循環(huán)中間體可以減少補(bǔ)料分批培養(yǎng)中乳酸和銨的積累，并提高細(xì)胞特異性生產(chǎn)力和抗體滴度。實(shí)踐表明，使用7 升生物反應(yīng)器在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中設(shè)計(jì)連續(xù)補(bǔ)料策略。由于 7 升生物反應(yīng)器中有大量營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料培養(yǎng)基，連續(xù)補(bǔ)料減少了乳酸和銨的積累，從而可以促進(jìn)C12抗體的產(chǎn)量增加。所以，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中應(yīng)當(dāng)避免副產(chǎn)物，建議分批補(bǔ)料培養(yǎng)選擇可用的補(bǔ)料策略，以降低代謝副產(chǎn)物積累的可能性和濃度。生物反應(yīng)器中代謝副產(chǎn)物乳酸可以使用Biosen C-Line 乳酸分析儀進(jìn)行實(shí)時(shí)分析與調(diào)整。

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