需要而未提供的試劑和器材

1  .標準規(guī)格酶標儀。

2  .自動洗板機。

3,恒溫箱

4  .系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器。

5  .干凈的試管和Eppendof管。

6  .用去離子水將25X洗滌緩沖液稀釋25倍，成1X洗滌緩沖液。

注意事項

1  .使用前TMB顯色液應(yīng)為無色透明溶液，若發(fā)現(xiàn)顏色異常，請及時與廠家聯(lián)系。

2  .用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

3  要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活。

4  .為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。

5  .禁止混用不同批次試劑盒內(nèi)的試劑。

6  .本公司提供的96孔酶標板是單條可拆型酶標板，用戶可按需求使用；剩余的酶標板請 按保存條件貯存。

7  .揭封板膜和覆蓋封板膜時應(yīng)避免用力過大導致液體濺出。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水 紙，酶標板朝下用力拍幾次；將1X洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù) 需要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準備和保存

樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。

細胞培養(yǎng)上清一一離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

血清一一用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時，離心1000Xg 15分鐘，收集血清。立即 分析或分裝后-20℃冷凍保存。

血漿一一用干凈試管收集肝素抗凝血液，30分鐘內(nèi)離心，1000Xg 15分鐘，收集血漿。立 即分析或分裝后-20℃冷凍保存。EDTA或檸檬酸鹽抗凝血不適合。

細胞裂解液一一對于貼壁細胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。 加入適量裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常10 秒后，細胞就會被裂 解。對于懸浮細胞，離心收集細胞，用PBS、 生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量 裂解液，用槍吹打把細胞吹散，用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后， 10000—14000g 離心3-5分鐘，取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

試劑的準備和保存

A. ACE標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準備。

試劑盒提供2管標準品，每管10ng,每次使用1管。

1,  配制10,000pg/ml標準品：取1ml樣品稀釋液加入標準品管內(nèi)，蓋好后靜置10分鐘以 上，然后反復顛倒/搓動以助溶解。

2,  配制6000pg/ml標準品：取0.6ml 10,000pg/ml的標準品加入有0.4ml樣品稀釋液的

Eppendorf管中，混勻，做上標記。

3,配制3000pg/mlf 93.8pg/ml標準品：準備6只Eppendorf管，每管加0.3ml樣品稀釋 液，分別標記上 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 。 取0.3ml 6000pg/ml的標準品加入標記3000pg/ml的管中，混勻后同樣取出0.3ml ,加入 下一只管中。余同此類推，直到最后一只樣品管。

注意：已經(jīng)稀釋的標準品（10,000pg/ml）,應(yīng)在12小時內(nèi)使用。-20℃冷凍保存條件 下，2天內(nèi)可以使用，但不得反復凍融。

1  .生物素標記抗小鼠ACE抗體工作液的準備：在使用前2小時內(nèi)準備。

1  .根據(jù)每孔需要100ul計算總的用量（實際配制時應(yīng)多配制100ul-200ul）。

2  .按1ul生物素標記抗小鼠ACE加抗體稀釋液99ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C.親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備。

1  .根據(jù)每孔需要100ul計算總的用量（實配時應(yīng)多配制100ul-200ul）。

2  .按1ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液99ul的比例配制工作液。輕 輕混勻。

操作程序

己稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標板孔前都應(yīng)預先在37℃中平衡至少30分鐘。 試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻 。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。用戶須估計樣品待測 因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)。

1  .確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目，并增加1孔作為TMB空白顯色 孔?？倲?shù)=樣品數(shù)+9；做雙份檢測時又2。其余重包裝好放入冰箱中。

2  . 將 6000pg/ml , 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 的

標準品各100ul依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于血清、 血漿、細胞裂解液或細胞培養(yǎng)上清，每孔加100ul已用樣品稀釋液稀釋的樣品。

1 .酶標板加上封板膜，37。。反應(yīng)90分鐘。

2 .反應(yīng)后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體；或甩去酶標板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾 下。不洗。

3 .將準備好的生物素抗小鼠ACE抗體工作液按每孔100ul依次加入。（TMB空白顯色孔 除外）。酶標板加上封板膜，37℃反應(yīng)60分鐘。

4 . 1X洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右（每孔洗液至少300ul）。

5 .將準備好的ABC工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白顯色孔除外）。酶標板加封 板膜，37℃反應(yīng)30分鐘。

6 . 1X洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右（每孔洗液至少300ul）。

7 .按每孔90ul依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)15-20分 鐘（注意：顯色時間供參考，因用戶實驗室條件差異，最佳顯色時間會有所不同。此 時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯）。

8 .按每孔100ul依次加入終止液，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。

9 .用酶標儀在450nm測定O.D.值。

有兩種設(shè)定空白對照的方案：

（1）將TMB空白顯色孔（只加TMB顯色液和終止液）設(shè)為對照。所有的標準品和樣 品的吸光值減去TMB空白顯色孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為 縱坐標，以濃度作為橫坐標。

（2）將零孔設(shè)為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，得到的數(shù) 據(jù)可以直接在坐標紙上畫出曲線。

12.根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。

應(yīng)記住由于樣品稀釋了 N倍，其實際濃度應(yīng)該XN。

1 .加樣品和標準品，37℃反應(yīng)90分鐘。不洗。

2 .加生物素標記抗體，37℃反應(yīng)60分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌3次。

3 .加ABC, 37℃反應(yīng)30分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌5次。

4 . TMB37℃反應(yīng) 15-20 分鐘。

5 .加入終止液，讀數(shù)。

典型數(shù)據(jù)

TMB37℃反應(yīng)15分鐘。

（數(shù)據(jù)供參考，不同用戶最佳顯色時間會有所不同）