細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-Alexa Fluor 647/PI）

   貨號(hào)                 規(guī)格

 BDLS4002-20     20T

 BDLS4002-50      50T

 BDLS4002-100    100T 

檢測(cè)方法：采用 Annexin V 與 PI 雙染的方法

 儲(chǔ)存條件：2-8℃避光保存（勿冰凍） 

    細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒介紹：

      細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS) 從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使 PS 暴露在細(xì)胞膜外表面。PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常 主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使 PS 暴露在細(xì)胞膜外。

   Annexin V 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性，對(duì) PS 有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用 Annexin V 與 PI 雙染的方法，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。 

注意事項(xiàng)：

本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。此產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床

試劑盒組份 

1. 結(jié)合緩沖液 4× (Binding Buffer 4×) 體積：20 Tests: 4ml（4 倍濃縮液） 50 Tests: 10ml（4 倍濃縮液） 100 Tests: 20ml（4 倍濃縮液） 

稀釋后溶液中各組分濃度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2 2. 碘化丙錠溶液 （Propidium Iodide, PI） 

體積： 20 Tests: 0.2ml； 50 Tests: 0.5ml ；100 Tests: 1.0ml 

濃度： 20μg/ml 

3. 重組人 Annexin V/Alexa Fluor 647 , (rh Annexin V/Alexa Fluor 647 ）

來(lái) 源：大腸桿菌（E.coli） 分 子 量：35.8 KDa 

樣 品 量：

20 Tests: 0.1ml，可用于 20 次實(shí)驗(yàn) 

 50 Tests: 0.25ml，可用于 50 次實(shí)驗(yàn)

 100 Tests: 0.5ml，可用于 100 次實(shí)驗(yàn) 

保存方法：于 50mM Tris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保存 

純 度：SDS-PAGE 及反相 HPLC 表明純度大于 98% 

生物活性：Annexin V 可結(jié)合于磷酯酰絲氨酸并表現(xiàn)出抗磷酯酶活性 

實(shí)驗(yàn)操作步驟

 1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

 a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞， 至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的 貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。 

1000rpm 左右離心 5min，沉淀細(xì)胞。 對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離 心力。小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。

加入約 1ml 4℃預(yù) 冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。 

b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000rpm 左右離心 5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法完全 離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約 1ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心 沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。

 2. 用去離子水按 1:3 稀釋結(jié)合緩沖液（4ml 4x 結(jié)合緩沖液+12ml 去離子水）；

 3. 用 1x 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1-5x106 /ml；

 4. 取 100μl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V/Alexa Fluor 647 和 10μl 20μg/ml 的碘化丙錠溶液；混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘； 

5. 加入 10ul 20ug/ml 的碘化丙錠溶液（PI）,并加 400μl PBS，立刻流式檢測(cè)。 

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

 1)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 647 ，碘化丙錠溶液(PI)。用于調(diào)節(jié)電壓。 

檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647 ，碘化丙錠溶液(PI)。

用空白管和單陽(yáng) 管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

 注：無(wú)需用單染管 Annexin V/Alexa Fluor 647 調(diào)補(bǔ)償。 

2) 轉(zhuǎn)染 GFP 細(xì)胞 未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液(PI)。

用于調(diào)節(jié) 電壓 轉(zhuǎn)染 GFP 空白管：轉(zhuǎn)染 GFP 對(duì)照組細(xì)胞，不加轉(zhuǎn)染 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠 溶液(PI)。

用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償 檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液(PI)。調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償 后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

 常見(jiàn)問(wèn)題：

 1、 Annexin V/ PI 凋亡檢測(cè)的試劑盒能否檢測(cè)人以外其他動(dòng)物的細(xì)胞凋亡情況？

 可以。因?yàn)?Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而 PS 在不同種屬間沒(méi)差異。在正常細(xì)胞中，PS 只 3 / 3 分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，PS 由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。

 2、 貼壁細(xì)胞做凋亡用胰酶消化下來(lái)對(duì)細(xì)胞膜損傷？

 低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞 2～3 次，離心機(jī) 4℃1000rpm 5min 離心，處理得當(dāng)?shù)脑?，胰酶造?損傷可以控制在 5%以內(nèi)，有對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。

 3、 貼壁細(xì)胞可以先染 PI 然后再消化下來(lái)嗎？

這樣是否可以減小由于消化液造成的細(xì)胞 膜破損而染上的 PI 的誤差？ 

先加 PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI 本身對(duì)細(xì)胞也是有毒性的，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì) 比胰酶大，不建議這樣做。

 4、 為什么只能用不含 EDTA 的胰酶消化貼壁細(xì)胞，用含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞對(duì)結(jié)果有 什么影響？

 因?yàn)?Annexin V 是 Ca 依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V，進(jìn)而影響結(jié)果。 

5、 有些廠家說(shuō)明書(shū) Annexin V 和 PI 一起加？為什么你們先加 Annexin V 后加 PI？ 

用流式檢測(cè)凋亡時(shí)，PI 受時(shí)間的影響很大，因標(biāo)記了 PI 后會(huì)加大細(xì)胞毒性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致 PI 的 染色增加，特別是檢測(cè)早期凋亡時(shí)，如果時(shí)間延長(zhǎng)除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤 差會(huì)明顯加大。一般 PI 加上后立刻上機(jī)，然后在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完成。兩種方法都可以，但是按照我們 操作步驟造成的誤差會(huì)更小。

 6、 你們哪種凋亡檢測(cè)試劑盒能用于轉(zhuǎn)染 GFP 細(xì)胞的凋亡檢測(cè)？

 BDLS4004 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit 凋亡檢測(cè)試劑盒 BDLS4002 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 凋亡檢測(cè)試劑盒 實(shí)驗(yàn)參考圖片 Jurkat 細(xì)胞用順鉑誘導(dǎo)凋亡后用 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 雙染流式分析圖譜