CCK-8 細胞增殖與活性檢測試劑盒- cck8法檢測細胞活力

貨號	規(guī)格
BDXB0002-5	5ml
BDXB0002-10	10ml
BDXB0002-30	30ml

產(chǎn)品概述

       CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一種基于WST（水溶性四唑鹽，一種類似于MTT的化合物）的細胞增殖與活性檢測試劑盒，用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測。在電子耦合試劑存在的情況下，WST被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培養(yǎng)基中。細胞增殖越多越快，則培養(yǎng)基的顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，生成甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。
 
用途
       用于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物的篩選、細胞增值的測定、細胞毒性檢測以及藥敏等與細胞活性和增殖相關的實驗。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經(jīng)配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即開即用，無需其他準備步驟。檢測過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶標儀上檢測，適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測。

CCK-8與MTT法的比較


CCK-8法	MTT法
還原后的甲臜是水溶性的（不需要溶解）	還原后的甲臜是非水溶性的（需要加有機溶劑溶解）
重現(xiàn)性好	重現(xiàn)性差
操作簡單	操作繁瑣
測定波長：450-490nm	測定波長：550-600nm
單一溶液，即開即用	需要加有機溶劑，有毒性




參考數(shù)據(jù)：

（1）CCK-8與MTT、XTT、MTS試劑盒比較圖

（2）博奧龍CCK-8與其它公司產(chǎn)品比較圖


---

使用方法

 一、制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量時）

 1. 先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞。

2. 按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個 細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。 

3. 接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出 一條以細胞數(shù)量為橫坐標，OD值為縱坐標的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未 知樣品的細胞數(shù)量（適用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，尤其加入CCK-8后的 培養(yǎng)時間要一致）。

二、細胞活性檢測 1. 在96孔板中接種細胞懸液（100μl/孔）。

1.將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（37℃，5% CO2）。

2. 向每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD的讀數(shù)）。 

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。 

4. 用酶標儀測定450nm處的吸光度。 

5. 如果暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μl的0.1M的HCl溶液或1% w/v SDS溶液， 并遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存，24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。 

三、細胞增殖-毒性檢測（以96孔板為例） 

1. 在96孔板中配置100μl的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μl約2000個細胞，細 胞毒性實驗每孔加入100μl約5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的 大小、細胞增殖速度的快慢等因素決定）。按照實驗需要，進行預培養(yǎng)。 

2. 向培養(yǎng)板加入1-10μl不同濃度的待測藥物刺激。

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（后面有具體細胞的建議時間，例如：6、12、 24或48小時）。

4. 每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD讀數(shù)）。如果起 始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推?？梢杂眉恿讼?應量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作空白對照。如果擔心所使用的藥物 會干擾檢測，需設置加了相應量細胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作 為空白對照。 

5. 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時（對于大多數(shù)情況孵育1小時就可以）。時間的長短根 據(jù)細胞的類型和細胞的密度等情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2 和4小時候分別 用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。 

6. 用酶標儀測定在450nm處的吸光度。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參 考波長進行雙波長測定。 

7. 如果暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液， 并遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存，24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。 

注意：如果待測物質(zhì)有氧化或還原特性，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（先用培養(yǎng) 基洗滌細胞兩次），去掉藥物影響。如果藥物影響比較小，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣 除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。 

活力計算

 細胞活力*（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）] ×100 A

（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A

（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度 A

（0 加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力 

注意事項

1. 由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面， 由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng) 液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。 

2. CCK-8檢測細胞活性原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應。任何待測體系中存在還原劑，例一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。

3. 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。

 4. 建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK試劑時，建議斜貼著培 養(yǎng)板壁加，不要查到培養(yǎng)基液面下加樣，溶液產(chǎn)生氣泡，會干擾OD讀數(shù)。

 5. 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μl培養(yǎng)基）。檢測 白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500個/孔（100μl培養(yǎng)基），且培 養(yǎng)時間長一些。如果要使用24孔板或6孔板實驗，需先計算每孔相應的接種量，并按照 每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。 

6. 加入CCK-8溶液時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色已變化或pH值變化，建議換 用新鮮的培養(yǎng)基。 

7. 如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在450-490nm之間的濾光片，但是450nm濾 光片的檢測靈敏度最高。

8. 酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過 扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。